基本信息
題目：
High Intensity Focused Ultrasound-Responsive and Ultrastable Cerasomal Perfluorocarbon Nanodroplets for Alleviating Tumor Multidrug Resistance and Epithelial–Mesenchymal Transition
期刊：ACS NANO
影響因子：14.588
PMID：33175487
通訊作者：梁曉龍副研究員和王凡教授
作者單位：北醫三院和北京大學
摘 要
缺氧是大多數實體腫瘤的典型特征，常常導致多藥耐藥（MDR），并導致化療失敗。缺氧還可促進上皮-間充質轉化（EMT），加速腫瘤轉移。許多化療藥物可進一步加重缺氧，從而促進轉移。因此，緩解缺氧是化療抑制MDR和EMT的必要條件。本研究中，作者構建了一種具有聚有機硅氧烷表面原子層和pH敏感腫瘤靶向肽的超穩定全氟化碳硅質體納米液滴（D-vPCs-O2），用以實現氧氣和阿霉素（DOX）在腫瘤區域的定點可控遞送。利用HIFU觸發DOX和氧氣的共釋放并同時增強超聲成像，實現了成像引導下的藥物遞送。M-HIFU不僅觸發了納米液滴中的氧氣釋放，同時使腫瘤溫度略微升高，加速腫瘤的血流灌注量，進一步改善腫瘤缺氧。由于硅質體超穩定的載藥量，總體副作用也大大降低。化療和缺氧的改善共同下調轉化生長因子-β（TGF-β1）的表達量，導致EMT減輕，從而顯著抑制腫瘤轉移。當D-vPCs-O2+M-HIFU被用作新輔助化療時，顯著下調熱休克蛋白，從而減少高溫HIFU（H-HIFU）介導的高溫熱消融后的腫瘤復發。化學熱療**了腫瘤，且無復發和轉移，為惡性程度高、易轉移、缺乏有效治療手段的三陰性乳腺癌提供了一條有前途的治療途徑。
研究內容及結果
1. D-PFH-vPC具有良好的載藥穩定性和超聲成像增強能力
利用四種常用的PFCs（PFP、PFH、PFOB和PFCE）制備了四種D-vPCs；同時，D-VPL是利用正常磷脂代替硅質體制備的。通過冷凍蝕刻掃描電子顯微鏡對四種D-VPC的形態進行了表征（圖1a），發現所有D-VPC均為球形，直徑相對均勻。對納米液滴的理化特性進行分析（圖1b-h），結果顯示：研究發現D-PFP-vPCs缺乏形態穩定性和載藥穩定性；而D-PFOB-vPCs和D-PFCE-vPCs的DOX包封效率低、對M-HIFU觸發的DOX釋放反應速度慢、缺乏增強超聲成像的能力。D-PFH-vPCs同時具有良好的穩定性和增強超聲成像的能力。
圖1
2. vPCs-O2+M-HIFU可以有效緩解體外缺氧介導的MDR和EMT
作者首先檢測vPCs的主動腫瘤靶向能力，在溫和的酸性環境中用vPCs孵育細胞后的平均熒光強度是中性環境（pH7.2-7.4）中的2.5倍，顯示了var7靶向酸性腫瘤環境的能力（圖2a）。然后，檢測了載氧vPCs對腫瘤缺氧狀態的影響，結果顯示：vPCs-O2+M-HIFU與細胞共孵育后，缺氧的4T1細胞轉化為較低的缺氧狀態（圖2b）；MDR相關基因如MDR1、HIF-1α和P-gp的表達量顯著降低（圖2c、d和e）。當用D-vPCs-O2+M-HIFU處理細胞時，與D-vPCs-N2+M-HIFU相比，DOX攝取增加了103.8%，細胞活力顯著降低62.5％，細胞凋亡活性顯著增加111.3％（圖2f-h）。綜上所述，D-vPCs-O2+M-HIFU超聲可以緩解腫瘤細胞缺氧狀態，下調MDR相關基因和蛋白表達，增加細胞內DOX積累。
進一步研究了D-vPCs-O2+M-HIFU對EMT的影響。經vPCs-O2+M-HIFU處理后，遷移和侵襲細胞數量分別顯著減少70.8%和65.4%（圖2i、j）。在D-vPCs-O2+M-HIFU處理后，與D-vPCs-N2+M-HIFU相比，遷移細胞和侵襲細胞的數量分別顯著減少了67.0%和71.6%。ELISA定量EMT標記物的表達水平，結果如圖2k所示，vPCs-O2+M-HIFU顯著下調缺氧細胞TGF-β1和EMT標記物如鈣粘蛋白E、Vimentin和Twist的表達水平，而低濃度DOX顯著上調其表達水平。D-vPCs-O2+M-HIFU進一步下調已經上調的TGF-β1和EMT標記物。這表明vPCs-O2+M-HIFU可有效抑制腫瘤細胞的EMT轉化。
圖2
3. 體內熒光成像、生物分布和M-HIFU介導的藥物釋放研究
由于DOX不適用于活體成像，制備了Cy7-vPCs、Cy7-vPLs和Cy7-Doxil。靜脈注射給單層4T1荷瘤BALB/c小鼠，體內熒光成像結果顯示：Cy7-vPCs+M-HIFU的腫瘤熒光強度曲線下面積（AUC0-72h）比Cy7-vPCs的升高4.6倍（圖3a和b）；Cy7-vPCs+HIFU的AUC0-72h比Cy7-PCs+HIFU的高1.7倍（圖3a，b）。中和的腫瘤AUC0-72h明顯低于未處理的腫瘤，進一步顯示了var7靶向酸性腫瘤微環境的能力。
采用雙側異種移植瘤評估Cy7-vPCs和D-vPCs的M-HIFU反應性。如圖3c所示，靜脈注射后，僅用M-HIFU超聲處理腫瘤的一側。MDA-MB-231荷瘤BALB/c裸鼠（圖3d）或4T1荷瘤鼠（圖3e）注射游離Cy7、Cy7-vPCs或Cy7-Doxil。注射Cy7-vPCs后，經M-HIFU超聲處理的一側腫瘤的熒光明顯高于未經超聲處理的另一側腫瘤。DOX（或Cy7）的生物分布顯示：D-vPCs+M-HIFU處理后，明顯增加了在腫瘤中的DOX累積；顯著降低了心臟中的DOX蓄積（圖3g-h）。
圖3
4. D-vPCs+M-HIFU可以有效緩解體內腫瘤缺氧，實現超聲成像引導化療
在4T1荷瘤小鼠體內檢測vPCs緩解腫瘤缺氧的效果，評估化療的有效性。結果顯示，M-HIFU超聲聯合高氧呼吸使腫瘤缺氧區域面積減小（圖4a），降低了HIF-1α和P-gp的相對表達水平（圖4b）。D-vPCs-O2表現出較強的超聲（US）成像，并最終在整個腫瘤區域實現高頻信號擴散（圖4c）。這個過程伴隨著氧和DOX的釋放。因此，M-HIFU響應性超聲成像顯示出監測D-vPC中氧和DOX釋放的潛力，從而實現超聲成像引導化療。與其他實驗組相比，D-vPCs+M-HIFU表現出更好的腫瘤生長抑制作用（P<0.05），腫瘤生長抑制率高達94.6%，實現了最高比例的凋亡（> 90%），并且腫瘤核被廣泛破碎（圖4d-g）。
圖4
同時，進一步詳細研究了心臟損傷和骨髓抑制，因為它們是DOX的主要副作用。結果顯示：與其他實驗組相比，D-vPCs-O2+M-HIFU處理后，DOX在心臟組織中的積累顯著減少，DOX誘導心臟細胞的凋亡比例顯著降低（圖5a）。D-vPCs-O2+M-HIFU組的肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、白細胞（WBC）無明顯變化（圖5b-d），表明D-vPCs-O2+M-HIFU副作用極小，不會造成嚴重的心臟損傷和骨髓抑制。
圖5
5. vPCs-O2+M-HIFU有效緩解EMT和抑制肺轉移
通過小鼠活體成像檢查體內化療后肺癌移植瘤轉移。結果顯示：PBS組小鼠均有自發性肺轉移（圖6a）。相較于PBS組，vPCs-O2+M-HIFU組小鼠轉移至肺表面的癌細胞數量和面積顯著減少（圖6b-c）。比較腫瘤EMT標記物EMT相關基因表達量的變化（圖6d-h），表明vPCs-O2+M-HIFU能顯著緩解EMT。與D-vPCs+M-HIFU相比，D-vPCs-O2+M-HIFU不僅緩解了腫瘤缺氧，而且降低了缺氧介導的MDR，而增強化療在緩解EMT方面也可能具有協同作用。
圖6
6. D-vPCs-O2+M-HIFU可以減少熱療消融后的腫瘤復發
探究新輔助化療與熱療聯合治療的合理性，體外研究結果顯示：化療-熱療聯合治療的抗癌效果均明顯優于單獨化療或單獨熱療（圖7a）；同時，不管DOX濃度如何，協同作用依然明顯存在（圖7b）。在4T1荷瘤裸鼠中進一步進行聯合治療，發現PBS處理組經熱療消融后，所有腫瘤均快速復發（圖 7cI，dI）。
游離DOX或Doxil處理組經熱療消融后，復發腫瘤的百分比分別下降至 66.7% 和 50.0%（圖7dII，III）。D-vPCs-O2+M-HIFU處理組的抗腫瘤作用更強，在熱療后60天內未觀察到腫瘤復發和肺轉移（圖7cⅣ，dⅣ）D-vPCs-O2+M-HIFU的兩次給藥明顯降低了HSP-27和HSP-90的表達水平（圖7e），表明體內也存在協同效應。因此，D-vPCs-O2+M-HIFU適合作為新型輔助化療藥物，從而減少熱療消融后的腫瘤復發。
圖7
結 論
本研究中，作者成功制備了D-vPCs-O2納米液滴，實現了M-HIFU觸發的藥物和氧氣在腫瘤區域內的定點可控遞送。D-vPCs-O2+M-HIFU可顯著增加腫瘤內部的藥物蓄積，從而更好的抑制腫瘤的生長。D-vPCs-O2+M-HIFU還可使腫瘤缺氧大大緩解，MDR和EMT減輕，最終抑制腫瘤轉移。通過將D-vPCs-O2+M-HIFU和H-HIFU介導的高溫消融術相結合，可以提高藥物療效，減少副作用，能更好地抑制腫瘤復發。同時，該納米液滴具有良好的形態和超穩定的載藥穩定性，可以延長血液循環時間，降低心臟損傷和骨髓抑制。綜上所述，D-vPCs-O2+ M-HIFU展現出巨大的臨床應用潛力。
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